การแยกเพาะเลี้ยงและวิเคราะห์สารกลุ่มแคโรทีนอยด์ในสาหร่ายสีเขียวก่อโรคพืชสกุล Cephaleuros

Abstract

Cephaleuros เป็นสกุลหนึ่งของสาหร่ายสีเขียว (Chlorophyta) ที่เป็นเชื้อสาเหตุของโรคใบจุดสาหร่าย (algal leaf spot) หรือ โรคจุดสนิม (algal red rust) ในพืชหลายชนิด อย่างไรก็ตามรายงานและการศึกษาถึงสาหร่ายก่อโรคชนิดนี้ในประเทศไทยยังมีน้อยมาก งานวิจัยนี้จึงมีจุดประสงค์ที่จะเริ่มต้นการศึกษาโดยทำการสำรวจ จัดจำแนกชนิดและแยกเพาะเลี้ยง รวมไปถึงการศึกษารงควัตถุโดยเฉพาะเบต้าแคโรทีน (ß-carotene) ในสาหร่ายก่อโรคสกุลนี้ จากการสำรวจและเก็บตัวอย่างในพื้นที่บางส่วนของจังหวัดนครปฐมและสมุทรสาคร พบอาการของโรคจุดสาหร่ายในพืช 6 ชนิด ได้แก่ ส้มโอ มะนาว ฝรั่ง เฟินชายผ้าสีดา อโศกอินเดีย และชมพู่มะเหมี่ยว โดยพบรอยโรคบนส่วนใบของพืชเท่านั้นและมีลักษณะคล้ายคลึงกันในทุกตัวอย่างพืช กล่าวคือ โคโลนีของสาหร่ายก่อโรคมีรูปร่างค่อนข้างกลม ผิวหน้าฟูคล้ายกำมะหยี่ และมีสีส้มแดงคล้ายสีสนิมเหล็ก ซึ่งเมื่อศึกษาลักษณะสัณฐานวิทยาของสาหร่ายใต้กล้องจุลทรรศน์ อันได้แก่ ทัลลัส โครงสร้างสืบพันธุ์ และระดับการเข้าทำลายบริเวณของชั้นใบพืช พบว่า ตัวอย่างสาหร่ายทั้งหมดมีลักษณะตรงกับคำบรรยายของสาหร่าย Cephaleuros virescens ซึ่งสอดคล้องกับผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของตำแหน่งยีน 18S rRNA ที่ระบุว่าสาหร่ายทั้ง 6 ไอโซเลทที่สามารถแยกเพาะเลี้ยงให้เป็นสายพันธุ์บริสุทธิ์ได้ในห้องปฏิบัติการนั้นเป็นสาหร่ายสีเขียวในสกุล Cephaleuros ตัวอย่างสาหร่ายทั้งหมดได้รับการแยกเพาะเลี้ยงจากใบไม้ที่ติดเชื้อภายใต้สภาวะ autotroph ด้วยอาหารสูตร HSM จนได้เป็นสายพันธุ์สาหร่ายบริสุทธิ์ ปัญหาการปนเปื้อนจากเชื้อราเป็นอุปสรรคสำคัญในการแยกเพาะเลี้ยงสาหร่ายสกุลนี้ซึ่งแก้ไขได้ด้วยการถ่ายเชื้อซ้ำหลายๆ ครั้ง และเมื่อทดลองเลี้ยงสาหร่ายในอาหารเหลวสูตร BBM และ Bristol ปรากฏว่า เส้นสายของ Cephaleuros มีการเจริญเติบโตและพัฒนาจากสีเขียวเป็นสีส้มอมแดง ผลการวิเคราะห์ตัวอย่างสาหร่ายที่เปลี่ยนสีด้วยเครื่อง HPLC ระบุว่า สาหร่ายสังเคราะห์และสะสมเบต้าแคโรทีน เป็นสารสีชนิดเด่นเพียงชนิดเดียว พบปริมาณ ß-carotene content สูงสุด 26.40 µg/gDW จากตัวอย่างสาหร่ายที่เลี้ยงในอาหารสูตร BBM ซึ่งมากกว่าอาหารสูตร HSM ถึง 9 เท่า จากการทดลองเพิ่มเติมทำให้ทราบว่า การเปลี่ยนสีของเส้นสายสาหร่ายที่เกิดขึ้นมีสาเหตุมาจากการที่อาหารสูตร BBM และ Bristol นั้นมีโซเดียมไนเตรท (NaNO3) เป็นแหล่งของไนโตรเจนซึ่งต่างไปจากอาหารสูตร HSM ที่มีแหล่งของไนโตรเจนเป็นแอมโมเนียมคลอไรด์ (NH4Cl) ซึ่งเส้นสายสาหร่ายที่เลี้ยงในอาหารสูตรนี้จะมีสีเขียวเสมอ ประกอบกับเมื่อเปรียบเทียบมวลชีวภาพของสาหร่ายที่ได้จากการเลี้ยงในอาหารที่ต่างกัน พบว่า HSM ส่งเสริมให้เกิดมวลชีวภาพของสาหร่าย Cephaleuros ได้มากกว่าอาหารสูตร BBM และ Bristol ถึง 6 และ 7 เท่า ตามลำดับ จากผลการทดลองดังกล่าว เป็นไปได้ว่าสาหร่าย Cephaleuros สามารถใช้แอมโมเนียมคลอไรด์เป็นแหล่งไนโตรเจนได้ดีกว่าโซเดียมไนเตรท และเมื่อสาหร่ายขาดแคลนไนโตรเจนจึงตอบสนองสภาวะเครียดด้วยการสร้างและสะสมเบต้าแคโรทีน เมื่อทำการวิเคราะห์ค่าการเป็นสารต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดสาหร่ายด้วยวิธี DPPH assay พบว่า สาหร่ายที่เลี้ยงในอาหารสูตร BBM มีค่าความเป็นสารต้านอนุมูลอิสระสูงที่สุด โดยมีค่าที่แสดงในรูปของ EC50 อยู่ที่ 1.40 mg/ml ผลการศึกษาครั้งนี้เป็นข้อมูลยืนยันถึงการปรากฏของโรคพืชที่เกิดจากสาหร่าย Cephaleuros ในประเทศไทยอย่างเป็นทางการ อีกทั้งนำเสนอข้อมูลทางชีววิทยาหลายประการที่สามารถใช้ในการระบุถึงสาหร่ายก่อโรคสกุลนี้เบื้องต้นได้ รวมถึงข้อมูลวิธีการแยกเพาะเลี้ยงสาหร่ายจากตัวอย่างพืชติดเชื้อ และการศึกษาในครั้งนี้นับเป็นการค้นพบแหล่งเบต้าแคโรทีนแหล่งใหม่จากธรรมชาติพร้อมกับพบว่าสารสีชนิดนี้สามารถกระตุ้นให้สร้างเพิ่มขึ้นด้วยความเครียดจากการขาดไนโตรเจน Cephaleuros is a genus of green algae (Trentepohliaceae, Chlorophyta) that causes algal leaf spots or algal red rust disease in several higher plants. In Thailand, however, there are very few reports or studies about this alga. This research aimed to start the investigation of plant pathogenic algae by isolation, identification and cultivation including pigment analysis particularly ß-carotene. Algal samples were obtained from Nakhon Pathom province and Samut Sakhon province. Symptoms of algal spots were found in 6 host plants namely; pomelo, lime, and guava, as well as disk staghorn, mast tree and pomerac. The lesions found only on the surface of all infected leaves appeared to have similar characteristics, which are usually circular, raised and velvet colonies. These algal infections were visible as orange-rusty coloured patches. In addition, microscopic morphologies i.e. thallus, reproductive structure and degree of tissue damage, identified all samples as Cephaleuros virescens. Partial analysis of 18S rRNA gene sequences also indicated that all 6 unialgal isolates attained under laboratory condition are the green algae genus Cephaleuros. Algal isolation of infected leaf samples was initially performed in autotrophic condition using HSM medium to obtain unialgal cultures. During the isolation process, the algal cultures had mainly been hindered by fungal contamination. This problem was solved by repeated subculturing. Subsequently, after transferring all Cephaleuros isolates to BBM and Bristol liquid medium, the growing algal filaments were found to develop into a deep orange colour. Algal pigment analysis using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed that all the orange-coloured algal samples synthesized and accumulated only ß-carotene as the main pigment. The BBM culture revealed the highest ß-carotene content up to 26.40 µg /gDW, 9-fold higher than HSM cultures. Further investigation uncovered that the orange algal filament resulted from sodium nitrate (NaNO3), a nitrogen source in BBM and Bristol medium whereas the HSM medium containing ammonium chloride (NH4Cl) generally gives a green filament algal culture. A comparison of biomass production showed that the highest biomass was achieved from the HSM culture; they were 6 and 7-fold higher than those obtained from BBM and Bristol mediums, respectively. It is, therefore, assumed that Cephaleuros can utilize NH4Cl as a nitrogen source better than NaNO3. On the other hand, a limitation of nitrogen source triggered the alga to accumulate ß-carotene in response to the nitrogen starvation stress. Antioxidant activity of algal crude extracts was determined by DPPH assay. The results indicated that BBM cultures had the highest antioxidant activities, expressed as EC50 1.40 mg/ml. This research confirmed the existence of plant diseases caused by parasitic alga Cephaleuros in Thailand and offered the biological information for its identification including basic information for the isolation and cultivation of this parasitic alga from infected plant samples. This study also discovered a new natural ß-carotene source and that nitrogen starvation stress enhances ß–carotene production in the algal culture.