MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF DENGUE VIRUS ISOLATED FROM SERA OF PATIENTS WITH SUSPECTED DENGUE FEVER IN BANGKOK, THAILAND SINCE 2006 ASSOCIATED WITH CONSTRUCTION AND CHARACTERIZATION OF INFECTIOUS CLONE DENGUE 4 1036 PDK40

Abstract

Dengue fever, dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome are mosquito-borne infectious diseases. These diseases have been caused by dengue virus serotype 1, 2, 3, and 4 (DENV1-4), Family Flaviviridae, genus Flavivirus in sub-tropical and tropical regions. Different serotypes and genotypes of DENV may play an important role in disease severity among dengue patients. Up to date, dengue vaccine is no available. The aims of this study (i) to evaluate the molecular epidemiology of DENV isolates of patient sera in C6/36 cells by qRT-PCR, DNA sequencing and phylogenetic tree and (ii) to construct and evaluate biological markers of IC DEN4V 1036 PDK40.

qRT-PCR reveals 75 positive isolates consist of DENV1 (n=15), DENV2 (n=20), DENV3 (n=28) and DENV4 (n=12). DNA sequencing and phylogenetic tree analysis demonstrated genotype I of DENV1, genotype Asian I of DENV2 and genotype I of DEN4V. DEN3V consisted of genotype II (n=6) and genotype III (n=22). Report of dengue survey in Thailand revealed that DENV3 genotype II has been found since 1973, while genotype III has been found since 2008.

IC-DEN4V-1036-PDK40 was constructed by utilizing live attenuated (LAV) DEN4V 1036 PDK40. Three fragments of DEN4V 1036 PDK40 and 1 fragment of cloning vector were assembled by using the Gibson assembly method. RNA of IC-DEN4V-1036-PDK40 was synthesized and transfected into Vero cells. The rescued virus was amplified in Vero cells for 5 passages to achieve satisfactory viral titers. IC-DEN4V-1036-PDK40 showed attenuated characterization including small/pinpoint plaque size, temperature sensitivity and low growth efficiency in Aedes. aegypti. These results indicate safety of IC-DEN4V-1036-PDK40. This infectious clone might be useful for use as vaccine or a backbone for construct chimera vaccine.

โรคไข้เด็งกี่, โรคไข้เลือดออก และโรคไข้เลือดออกที่มีอาการช้อคร่วมเป็นโรคติดต่อผ่านทางยุง โรคเหล่านี้มีสาเหตุมาจากเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรทัยป์ 1, 2, 3, และ 4, วงศ์ Flaviviridae, สกุล Flavivirus พบในเขตร้อนชื้นและกึ่งร้อนชื้น ซีโรทัยป์และจีโนทัยป์ที่แตกต่างกันของเชื้อไวรัสเด็งกี่อาจมีบทบาทสำคัญเกี่ยวกับความรุนแรงของโรคในผู้ป่วยโรคไข้เด็งกี่ จวบจนปัจจุบันยังไม่มีวัคซีนป้องกันโรคเด็งกี่ วัตถุประสงค์ในการศึกษาครั้งนี้คือ (1) เพื่อประเมินการระบาดทางอณูโมเลกุลของเชื้อไวรัสเด็งกี่จากซีรั่มผู้ป่วยซึ่งแยกในเซลล์ยุงด้วยวิธี qRT-PCR, วิธี DNA sequencing และวิธี phylogenetic tree และ (2) การสร้างและการประเมินเครื่องหมายทางชีวภาพของโคลนติดเชื้อไวรัสเด็งกี่ 4 สายพันธุ์ 1036 PDK 40

วิธี qRT-PCR ตรวจพบเชื้อไวรัสเด็งกี่ 1 จำนวน 15 ราย เชื้อไวรัสเด็งกี่ 2 จำนวน 20 ราย เชื้อไวรัสเด็งกี่ 3 จำนวน 28 ราย และ เชื้อไวรัสเด็งกี่ 4 จำนวน 12 ราย วิธี DNA sequencing และ phylogenetic tree ระบุว่าเชื้อไวรัสเด็งกี่ 1 จัดอยู่ในจีโนทัยป์ I, เชื้อไวรัสเด็งกี่ 2 จัดอยู่ในจีโนทัยป์ Asian I และเชื้อไวรัสเด็งกี่ 4 จัดอยู่ในจีโนทัยป์ I ในขณะที่ เชื้อไวรัสเด็งกี่ 3 จัดอยู่ในจีโนทัยป์ II (6 ราย) และ จีโนทัยป์ III (22 ราย) รายงานการในประเทศไทยระบุว่ามีการระบาดของเชื้อไวรัสเด็งกี่ 3 จีโนทัยป์ II ตั้งแต่ปีค.ศ. 1973 และจีโนทัยป์ III ตั้งแต่ปีค.ศ. 2008

สร้างโคลนติดเชื้อไวรัส IC-DEN4V-1036-PDK40 ด้วยการใช้ DEN4V 1036 PDK40 การรวมกันของ 3 ชิ้นจาก DEN4V 1036 PDK40 และ 1 ชิ้นจากเวคเตอร์ด้วยวิธี Gibson assembly สังเคราะห์ RNA ของ IC-DEN4V-1036-PDK40 และนำเข้าสู่ Vero cells เพิ่มปริมาณไวรัสใน Vero cell จำนวน 5 รอบ เพื่อให้ได้ปริมาณไวรัสที่เพียงพอ IC-DEN4V-1036-PDK40 แสดงคุณสมบัติความอ่อนฤทธิ์ ซึ่งประกอบไปด้วยพลาคขนาดเล็ก ไวต่ออุณหภูมิ ลดประสิทธิภาพการเพิ่มจำนวนในยุง Aedes aegypti ผลการทดลองระบุปลอดภัยของโคลนติดเชื้อ IC-DEN4V-1036-PDK40 โคลนนี้น่าจะมีประโยชน์สำหรับการใช้เป็นวัคซีน หรือเป็นแกนหลักสำหรับสร้างเชื้อไวรัสลูกผสม