Purification and ฺBiochemical characterization of laccase from Bacillus sp.

Abstract

Laccase from Bacillus sp. strain P isolated from soil samples was purified by 60%(v/v) acetone precipitation, Q-Sepharose ion exchange and Sephacryl S-200 gel filtration chromatography. After purification, the specific activity of 34.09 U/mg proteins and the purification fold of 11.84 were obtained. The molecular weight estimated by Native PAGE and Gel filtration chromatography was 181 and 184 kDa, respectively. The optimum pH and temperature were 9.0 and 60 ºC, respectively while the pH and temperature stability were found at pH 8.0 and 4 ºC. The metal ions, Mg2+, Mn2+, Cu2+ and Hg+, enhanced the laccase activity while Co2+, Fe2+, Zn2+, Ni2+ and Ca2+ showed the inhibitory effect. Laccase was inhibited by EDTA, sodium azide and 2-mercaptoethanol. Laccase was stable in 1mM SDS and 50%(v/v) DMF, DMSO, ethanol and acetone. Laccases could oxidize a wide range of phenolic substate. Km, Vmax and kcatalytic for DMP were 0.722 mM, 0.414 mM.min-1 and 1830.36 min-1 , respectively. The enzyme could decolorize 10 ppm congo red with a decolorization percentage of 73.23% in 24 hr

แลคเคสจาก Bacillus sp. สายพันธุ์ P ที่คัดแยกจากดิน ถูกนำมาแยกบริสุทธิ์ โดยผ่านการตกตะกอนด้วย 60%(v/v) acetone, Q-Sepharose ion exchange และ Sephacryl S-200 gel filtration chromatography หลังกระบวนการแยกบริสุทธิ์เอนไซม์มีค่ากัมมันตภาพจำเพาะเท่ากับ 34.09 U/mg protein มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 11.84 เท่า เอนไซม์มีมวลโมเลกุลประมาณ 181 kDa โดย pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อกัมมันตภาพของแลคเคสบริสุทธิ์ที่ pH 9.0 อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส ตามลำดับ แลคเคสมีความเสถียรที่ pH 8.0 อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ไอออนของ Mg2+, Mn2+, Cu2+ และ Hg+ มีผลกระตุ้นกัมมันตภาพแลคเคส ขณะที่ Co2+, Fe2+, Zn2+, Ni2+ และ Ca2+ สามารถยับยั้งกัมมันตภาพแลคเคส แลคเคสถูกยับยั้งโดย EDTA, Sodium azide และ 2-mercaptoethanol การศึกษาความเสถียรของแลคเคสในสารซักล้างและตัวทำละลายอินทรีย์พบว่าแลคเคสมีความเสถียรใน 1mM SDS และใน 50%(v/v) DMF, DMSO, Ethanol และ Acetone แลคเคสสามารถออกซิไดซ์สารตั้งต้นกลุ่มฟีนอลได้หลากหลาย ค่า Km, Vmax และ kcatalytic เมื่อใช้ DMP เป็นสารตั้งต้นมีค่าเท่ากับ 0.722 mM, 0.414 mM.min-1 และ 1830.36 min-1 ตามลำดับ แลคเคสบริสุทธิ์สามารถลดความเข้มสี Congo red ได้ 73.23% ในเวลา 24 ชั่วโมง