Development of andrographolide analogue (3A.1)-loaded nanocarriers and 3A.1 nanosuspensions for cancer therapy

Abstract

In this study, 19-tert-butylsilyldiphenyl-8,17-epoxy andrographolide (3A.1)-loaded nanocarriers and 3A.1 nanosuspensions were developed for improving its aqueous solubility and antitumor efficacy. First, the pH-sensitive amphiphilic chitosan derivatives, i.e. N-naphthyl-N,O-succinyl chitosan (NSC), N-octyl-N,O-succinyl chitosan (OSC), N-benzyl-N,O-succinyl chitosan (BSC) and folate-conjugated NSC (Fol-NSC), were synthesized and were formulated polymeric micelles (PMs) for 3A.1 incorporation. The influence of entrapment methods, hydrophobic parts of copolymers, and initial amount of drug on physicochemical characteristics were investigated. Second, 3A.1 was entrapped into liposomes (LPs) including LPs and PEGylated LPs. The effect of lipid components and initial amount of drug on physicochemical properties was studies. Third, 3A.1 nanosuspensions (NSs) were fabricated by an anti-solvent technique, using NSC, OSC, and BSC as surface stabilizers. The effect of drug to polymer ratios and types of stabilizer on physicochemical properties was observed. The 3A.1-loaded PMs based on CS derivatives at 40%wt to polymer, prepared by dropping method provided the highest value of % entrapment efficiency (%EE) and loading capacity (LC). These PMs were in nanometer scale (<200 nm) and had spherical shape with highly negative charge. The release behaviors of 3A.1 from 3A.1-loaded PMs displayed a delayed release. The 3A.1-loaded LPs and PEGylated LPs showed the maximum values of %EE and LC at the initial drug content of 3.0 mmol. These LPs had vesicle size in nanometer range (<150 nm) with spherical shape and mildly negative charge. The release profile of PEGylated LPs was slower than that of LPs and drug solution. The 3A.1-NSs at an optimal drug to polymer ratio of 1.5:1 w/w had spherical shape with particle size in a nanoscale (<500 nm) with negative charge. To keep physical and chemical stability at least 6 months, the 3A.1-loaded PMs, 3A.1-loaded LPs, and 3A.1-NSs were stored at 4°C. The 3A.1-loaded PMs, LPs, and 3A.1-NSs showed a significant increase in the anticancer activity against colorectal cancer (CRC) cells with dose- and time-dependent manners, compared to free drug. In addition, these nanocarriers induced CRC cell apoptosis. Interestingly, the Fol-NSC PMs entrapped 3A.1 had greater suppression of cancer growth than the unconjugated NSC PMs due to enhancing cellular uptake via receptor-mediated endocytosis. The in vitro cell migration showed that free 3A.1 and both 3A.1-loaded PMs and LPs inhibited cell motility in CRC and oral cancer cells, compared with untreated cells. Moreover, the in vivo antitumor efficacy indicated that the effective 3A.1 dose of 40 mg/kg/day in group of 3A.1-NSs yielded higher inhibition of tumor growth rate and lower toxicity than that of free drug solution and blank NSs. Therefore, these nanocarriers and nanosuspensions could be great potential as drug delivery of 3A.1 for cancer treatment.

ในการศึกษานี้เป็นการพัฒนาตัวพายาระดับนาโนบรรจุอนุพันธ์แอนโดรกราโฟไลด์ (3A.1) และยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 เพื่อเพิ่มค่าการละลายน้ำและฤทธิ์ต้านเซลล์มะเร็ง ระบบแรกคือพอลิเมอริกไมเซลล์บรรจุ 3A.1 เตรียมจากอนุพันธ์ไคโตซานที่ไวต่อการเปลี่ยนแปลงพีเอช ได้แก่ N-naphthyl-N,O-succinyl chitosan (เอ็นเอสซี) N-octyl-N,O-succinyl chitosan (โอเอสซี) N-benzyl-N,O-succinyl chitosan (บีเอสซี) และเอ็นเอสซีที่ควบคู่กับหมู่โฟเลต สำหรับนำส่ง 3A.1 ในรูปแบบรับประทาน โดยศึกษาผลของวิธีบรรจุยาทางกายภาพที่แตกต่างกัน ชนิดของหมู่ไม่ชอบน้ำบนสายพอลิเมอร์สังเคราะห์ และปริมาณยาเริ่มต้นที่แตกต่างกันต่อสมบัติทางเคมีฟิสิกส์ของพอลิเมอริกไมเซลล์ ระบบที่สองเป็นการเตรียมลิโพโซมชนิดธรรมดา และเพกไจเลตลิโพโซม บรรจุสาร 3A.1 สำหรับนำส่งสารในรูปแบบยาฉีด โดยศึกษาผลขององค์ประกอบและความเข้มข้นของไขมันที่ใช้เตรียม และปริมาณยาเริ่มต้นที่แตกต่างกันต่อสมบัติทางเคมีฟิสิกส์ของลิโพโซม ระบบที่สามเป็นการเตรียมยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 ด้วยวิธีการตกตะกอนด้วยตัวต้านการละลายโดยใช้พอลิเมอร์สังเคราะห์ เอ็นเอสซี โอเอสซี และ บีเอสซี เป็นสารเพิ่มเสถียรภาพของระบบนี้ โดยศึกษาผลของปริมาณยาเริ่มต้น และชนิดของสารเพิ่มเสถียรภาพที่แตกต่างกันต่อสมบัติเคมีฟิสิกส์ของยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 ผลการทดลองพบว่า พอลิเมอริกไมเซลล์ที่เตรียมจากอนุพันธ์ไคโตซานบรรจุสาร 3A.1 ที่มีปริมาณยาเริ่มต้นต่อพอลิเมอร์ร้อยละ 40 โดยเตรียมด้วยวิธีทางกายภาพแบบหยดของเหลว มีค่าความสามารถในการบรรจุสารที่สูงที่สุด อนุภาคที่เตรียมได้มีขนาดเล็กระดับนาโนเมตร (น้อยกว่า 200 นาโนเมตร) มีรูปร่างทรงกลมและประจุไฟฟ้าที่พื้นผิวเป็นลบ การปลดปล่อย 3A.1 จากพอลิเมอริกไมเซลล์ในตัวกลางที่จำลองสภาวะของทางเดินอาหาร พบว่าปลดปล่อยสารแบบชะลอ ลิโซมแบบธรรมดาและเพกไจเลตลิโพโซม มีค่าความสามารถในการบรรจุ 3A.1 สูงที่สุดเมื่อใช้ปริมาณยาเริ่มต้น 3 มิลลิโมล ลิโพโซมที่เตรียมได้ มีขนาดเล็กระดับนาโนเมตร (น้อยกว่า 150 นาโนเมตร) มีรูปร่างทรงกลมและประจุไฟฟ้าที่พื้นผิวเป็นลบเล็กน้อย การปลดปล่อย 3A.1 จากเพกไจเลตลิโซม พบว่าช้ากว่าลิโซมแบบธรรมดา และสารละลายยา 3A.1 ส่วนตำรับยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 เมื่อเตรียมโดยใช้ปริมาณยาเริ่มต้นต่อพอลิเมอร์เท่ากับ 1.5:1 โดยน้ำหนัก จะให้ความเข้มข้นของสารในตำรับสูงที่สุด ยาแขวนตะกอนระดับนาโนที่เตรียมได้มีขนาดเล็กระดับนาโนเมตร (น้อยกว่า 500 นาโนเมตร) มีรูปร่างทรงกลมและประจุไฟฟ้าที่พื้นผิวเป็นลบ การทดสอบเสถียรภาพ พบว่าพอลิเมอริกไมเซลล์บรรจุ 3A.1 ลิโพโซมบรรจุสาร 3A.1 และยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 มีเสถียรภาพทางกายภาพและทางเคมีอย่างน้อย 6 เดือนเมื่อเก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส พอลิเมอริกไมเซลล์บรรจุ 3A.1 ลิโพโซมบรรจุสาร 3A.1 และยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 มีฤทธิ์ต้านเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรงดีกว่าสารละลาย 3A.1 โดยฤทธิ์ต้านเซลล์มะเร็งเป็นทั้งแบบที่ขึ้นกับความเข้มข้นของสาร และระยะเวลาของการทดสอบสาร อีกทั้งระบบนำส่งเหล่านี้สามารถเหนี่ยวนำการตายของเซลล์มะเร็งแบบอะพอพโทซิสได้ด้วย นอกจากนี้ พอลิเมอริกไมเซลล์บรรจุ 3A.1 ที่เตรียมจากเอ็นเอสซีที่ควบคู่กับหมู่โฟเลตเพื่อการนำส่งสารสู่มะเร็งเป้าหมาย สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งได้ดีกว่าพอลิเมอริกไมเซลล์ ทั้งนี้อาจเป็นเพราะระบบนี้ช่วยเพิ่มการนำส่งสารเข้าสู่เซลล์ด้วยกลไกเอนโดไซโทซิสที่เกิดขึ้นโดยอาศัยตัวรับ การศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการเคลื่อนที่ของเซลล์มะเร็งพบว่าทั้งสารละลาย 3A.1 และในรูปแบบบรรจุในตัวพาพอลิเมอริกไมเซลล์และลิโพโซมสามารถยับยั้งการเคลื่อนที่ของเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรง และเซลล์มะเร็งช่องปากได้ ผลการทดสอบประสิทธิภาพการรักษามะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรงในสัตว์ทดลอง พบว่ายา 3A.1 ขนาด 40 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมต่อวันของตำรับยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 มีค่ายับยั้งอัตราการเจริญเติบโตของก้อนมะเร็งที่มากกว่า และมีความเป็นพิษที่น้อยกว่ากลุ่มที่ได้รับสารละลาย 3A.1 และพอลิเมอร์เปล่า ดังนั้นตัวพายาระดับนาโน (พอลิเมอริกไมเซลล์บรรจุ 3A.1 และเพกไจเลตลิโพโซมบรรจุ 3A.1) และยาแขวนตะกอนระดับนาโนของ 3A.1 มีศักยภาพในการพัฒนาต่อยอดเป็นระบบนำส่ง 3A.1 เพื่อรักษาโรคมะเร็งในอนาคต