Effects of sugar addition on recombinant protein in Escherichia coli BL21(DE3)

Abstract

Recombinant protein expression in Escherichia coli BL21(DE3) is highly effective and widely used in industrial protein production. The method to obtain higher amount of protein production need to be developed. This project investigated the effect of sugar on recombinant protein production in E. coli BL21(DE3). Sugars, include glucose, galactose, fructose, mannose, arabinose, xylose, lactose, maltose, and sucrose, were added into both LB medium and auto-induction medium at concentration of 2, 4, 6, 8, and 10 g/L. Growth curves of E. coli BL21(DE3) at various conditions were determined by measuring OD600. The results showed that LB medium sugars could be divided into three groups based on their effect on E. coli BL21(DE3) growth sugars that inhibits cell growth, sugars that increases cell growth. However, inhibited and no effect sugars were observed in the cell growth on auto-induction medium. Then, the cell growth on LB media was only further investigated by adding these sugars to the growth of E. coli BL21(DE3) containing pET-11a or GFP-pET-11a. The effect of sugar on cell growth was still observed in the same tread as in E. coli BL21(DE3) where maltose and xylose sinificantly increase cell growth. Then, total protein concentration measuring by Bradford protein assay revealed that higher cell growth cause the higher total protein concentration. The examine protein molecular by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) found that was 26.9 kDa in size. Band intensity of GFP at each condition was examined by ImageJ software and it was found that the amount of GFP was not depended on the cell density. So sugar can increase cell E. coli BL21(DE3) growth but counld't increase recombinant protein concentration.

การแสดงออกของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ใน Escherichia coli BL21(DE3) เป็นระบบที่มีประสิทธิภาพสูงและนิยมใช้อย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมการผลิตโปรตีน ซึ่งต้องการการผลิตโปรตีนได้ในปริมาณมาก งานวิจัยนี้จึงศึกษาผลของการเติมน้ำตาลชนิดต่างๆต่อการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ในเซลล์ E. coli BL21(DE3) โดยเติมน้ำตาลกลูโคส กาแลคโตส ฟรุคโตส แมนโนส อะราบิโนส ไซโลส แลคโตส มอลโตส และซูโครส ที่ความเข้มข้น 2 4 6 8 และ 10 กรัมต่อลิตรในอาหาร LB broth และ auto-induction media แล้วนำไปวัดค่า OD600 เพื่อติดตามการเจริญเติบโตของเซลล์ พบว่าในอาหาร LB น้ำตาลส่งผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ 3 แบบคือน้ำตาลที่ยับยั้งการเจริญของเซลล์ น้ำตาลที่ไม่มีผลต่อการเจริญของเซลล์และน้ำตาลที่เพิ่มการเจริญของเซลล์ ในขณะที่ไม่มีน้ำตาลชนิดใดเลยที่เพิ่มการเจริญเติบโตของเซลล์ใน auto-induction media จากนั้นผู้วิจัยจึงศึกษาผลของน้ำตาลในการเพาะเลี้ยงเซลล์ E. coli BL21(DE3) ที่มีพลาสมิด pET-11a และ GFP-pET-11a น้ำตาลยังคงส่งผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ 3 แบบในทิศทางเดียวกัน โดยน้ำตาลมอลโตสและไซโลสเป็นน้ำตาลที่เพิ่มการเจริญเติบโตของเซลล์ทุกชนิด จากนั้นนำโปรตีนที่อยู่ในเซลล์มาวัดความเข้มข้นโปรตีนด้วย Bradford protein assay พบว่าเซลล์ที่มีการเจริญเติบโตสูงให้ความเข้มข้นโปรตีนทั้งหมดสูงเช่นกัน แล้วนำโปรตีนมาวิเคราะห์ขนาดโปรตีนด้วย sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) พบว่าโปรตีนมีขนาด 26.9 kDa จากนั้นทำการวิเคราะห์แถบโปรตีนด้วยซอฟแวร์ ImageJ เพื่อหาพื้นที่ใต้พีคของโปรตีน GFP พบว่าเซลล์ที่มีการเจริญเติบโตสูงไม่ได้มีความเข้มข้นโปรตีน GFP ที่สูง ดังนั้นน้ำตาลสามารถเพิ่มการเจริญของเซลล์ได้ส่งผลให้เพิ่มจำนวนโปรตีนทั้งหมดในเซลล์แต่ไม่เพิ่มความเข้มข้นของโปรตีนรีคอมบิแนนท์