CHARACTERIZATION OF POLYSACCHARIDE EXTRACTED FROM Lentinus velutinus STRAIN WCR1104 AGAINST IN VITRO ANTICANCER ACTIVITY

Abstract

The aim of this study was to evaluate some chemical properties and the anticancer activity of polysaccharides extracted from Lentinus spp. Several studies were reported about the pharmacological properties of L. edodes, especially anticancer properties. While the study of bioactive substance of other species was not much. In this work, four Lentinus were collected from Nakhon Pathom, Ratchaburi, and Kanchanaburi province. The morphology, and ITS sequence analysis revealed they were L. sajor-caju strain EB1001, L. swartzii strain EB1101, L. squarrosulus strain WCR1201, and L. velutinus strain WCR1104. Crude extracts of dried fruiting bodies and mycelia from five Lentinus spp. were extracted using two solvents, hot water and 95% ethanol, and evaluated for their total carbohydrates, proteins, reducing sugar, phenol contents, and cytotoxicity. The yield of crude extracts was 3.36 – 20.53% (w/w). Cytotoxicity was determined with 10 mg/mL of crude aqueous and 1 mg/mL of crude ethanolic extracts by using the [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) method. All extracts showed non-cytotoxicity against the normal cell lines, LLC-MK2 and L929 cells. The aqueous extracted from fruiting bodies of Lentinus velutinus (LVFB-Aq) displayed the highest anticancer activity against the HeLa and the HepG2 cells with 49.83% and 48.59% inhibition, respectively. The LVFB-Aq was further separated by re-precipitation method into 3 fractions. The main fraction (Fraction E4) could decrease the viability of both cancer cell lines, HeLa and HepG2, at concentration 5 mg/mL. Fraction E4 was fractionated by anion exchange chromatography into 6 fractions, which fraction E4N5 has the highest anticancer efficacy by significantly inhibiting the growth of HeLa cell line about 17% and 26.65% at concentration 1 and 2 mg/mL, respectively. The fraction E4N5 was purified by size exclusion chromatography into 3 substances e.g. LV1, LV2, and LV3. The average molecular weight of the polysaccharide LV2 was estimated to be ⁓336 kDa. It slightly inhibited the growth of cancer cell lines, which IC50 of HeLa and HepG2 at 48 h was 2,000 and 1,935 µg/mL, respectively and showed a lower antioxidant activity of approximately 40%SA at 2,000 µg/mL. These studies suggested that the extraction and purification method must be improved for obtaining the high effective anticancer substance from L. velutinus.

วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้ก็เพื่อที่จะศึกษาคุณสมบัติทางเคมี และกิจกรรมในการต้านเซลล์มะเร็งของสารสกัดพอลิแซคคาร์ไรด์จากเห็ดในจีนัส Lentinus ซึ่งเห็ดหอม L. edodes เป็นเห็ดในจีนัสนี้ที่มีการศึกษาเกี่ยวกับคุณสมบัติทางเภสัชวิทยาเป็นจำนวนมาก โดยเฉพาะคุณสมบัติในการต้านเซลล์มะเร็ง ในขณะที่การศึกษาเกี่ยวกับเห็ดสปีชี่ส์อื่นๆในจีนัสนี้นั้นยังคงมีอยู่ไม่มากนัก ในงานวิจัยครั้งนี้ ได้ทำการศึกษาเห็ดในจีนัส Lentinus จำนวน 4 ไอโซเลตซึ่งได้มาจากจังหวัดนครปฐม, ราชบุรี และกาญจนบุรี โดยจากการศึกษาลักษณะฐานสัณฐานวิทยา ร่วมกับการวิเคราะห์ลำดับเบสในตำแหน่ง ITS ทำให้สามารถจัดจำแนกเห็ดทั้ง 4 ไอโซเลตได้เป็น L. sajor-caju สายพันธุ์ EB1001, L. swartzii สายพันธุ์ EB1101, L. squarrosulus สายพันธุ์ WCR1201 และ L. velutinus สายพันธุ์ WCR1104 นำเห็ดทั้งสี่ชนิด และเห็ดหอมมาสกัดสารสกัดหยาบจากตัวดอกเห็ด และเส้นใย โดยการใช้การสกัด 2 วิธี คือ การสกัดด้วยน้ำร้อน และการสกัดด้วยเอทานอล จากนั้นจึงนำไปศึกษาองค์ประกอบของคาร์โบไฮเดรต, โปรตีน, น้ำตาลรีดิวซ์ และฟีนอล รวมไปถึงนำไปทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ด้วย ซึ่งพบว่าสารสกัดน้ำ และเอทานอลมีปริมาณของผลผลิตอยู่ที่ 3.36 – 205.3 %โดยน้ำหนัก และเมื่อทำการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัดน้ำที่ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และสารสกัดเอทานอลที่ความเข้มข้น 1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ด้วยวิธี MTT แล้วพบว่าสารสกัดทั้งหมดไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ LLC-MK2 และ L929 ซึ่งเป็นเซลล์ปกติ และพบว่าสารสกัดน้ำจากดอกเห็ดของ Lentinus velutinus (LVFB-Aq) สามารถยับยั้งการเจริญของเซลล์มะเร็ง HeLa และ HepG2 ได้ถึง 49.83% และ 48.59% คามลำดับ ดังนั้นสารสกัดหยาบ LVFB-Aq จึงถูกนำไปแยกต่อด้วยวิธีการตกตะกอนซ้ำได้ทั้งหมด 3 ส่วน ซึ่งส่วนของสารสกัดหลัก (Fraction E4) สามารถยับยั้งการรอดชีวิตของเซลล์มะเร็งทั้งสองได้ที่ความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร จากนั้นนำ Fraction E4 ไปแยกต่อด้วยเทคนิค anion exchange chromatography ได้เป็น 6 ส่วน โดยที่ส่วนที่มีความสามารถในการต้านเซลล์มะเร็งได้ดีที่สุดคือ fraction E4N5 ซึ่งสามารถยับยั้งการเจริญของเซลล์ HeLa ได้ประมาณ 17% และ 26.65% ที่ความเข้มข้น 1 และ 2 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ และลำดับต่อมา fraction E4N5 ถูกนำไปทำให้บริสุทธิ์อีกครั้งด้วยเทคนิค size exclusion chromatography ได้เป็นพอลิแซคคาร์ไรด์ 3 ชนิด คือ LV1, LV2 และ LV3 โดยที่ พอลิแซคคาร์ไรด์ LV2 นั้นมีขนาดโมเลกุลเฉลี่ยประมาณ 336 กิโลดาลตัน อีกทั้งยังมีความสามารถในการยับยั้งเซลล์มะเร็ง HeLa และ HepG2 ได้ที่ 48 ชั่วโมง ซึ่งมีค่า IC50 อยู่ที่ 2,000 และ 1,935 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ และยังสามารถต้านอนุมูลอิสระได้ประมาณ 40% ที่ความเข้มข้น 2,000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร อย่างไรก็ตามจากการศึกษาครั้งนี้นั้นยังจำเป็นต้องมีการพัฒนาวิธีการสกัด และทำพอลิแซคคาร์ไรด์ให้บริสุทธิ์ เพื่อที่จะทำให้สามารถคัดแยก พอลิแซคคาร์ไรด์ที่มีประสิทธิภาพสูงในการต้านการเจริญของเซลล์มะเร็งออกมาได้